Hôm nay, chúng ta hãy nói về vấn đề đã gây ra vô số thí nghiệm đau đầu của các đồng nghiệp nghiên cứu - Western blot (WB). Điều này có vẻ đơn giản nhưng đầy đủ các thử nghiệm "bẫy", tại sao nó luôn khiến chúng ta vấp ngã nhiều lần? Bây giờ chúng ta hãy xem xét các lý do cho các thất bại cùng nhau.
I. Không có ban nhạc
Lý do có thể có thể bao gồm:
- Các vấn đề về kháng thể: Kháng thể có thể không hiệu quả, không đặc hiệu hoặc không liên kết với protein mục tiêu.
- Các vấn đề mẫu: Mẫu có thể chứa các chất gây nhiễu, nồng độ quá thấp hoặc đã bị suy giảm.
- Các vấn đề điện di: Các điều kiện điện di không phù hợp, chẳng hạn như điện áp, thời gian hoặc sử dụng bộ đệm không đúng.
- Các vấn đề chuyển giao: Các vấn đề trong quá trình chuyển, chẳng hạn như lựa chọn màng không phù hợp, thời gian chuyển hoặc bộ đệm chuyển.
- Các vấn đề chặn: Giải pháp chặn có thể không phù hợp hoặc thời gian chặn có thể quá dài.
- Các vấn đề nhuộm màu: Thuốc thử nhuộm có thể hết hạn, không nhạy cảm hoặc được sử dụng không đúng cách.
Vấn đề về thiết bị: Thiết bị có thể bị trục trặc hoặc không được hiệu chỉnh đúng.
- Các vấn đề hoạt động thử nghiệm: Hoạt động thử nghiệm có thể không được tiêu chuẩn hóa, chẳng hạn như không đủ rửa hoặc tải mẫu không đồng đều.
- Các vấn đề sửa đổi protein: Protein mục tiêu có thể trải qua các sửa đổi sau dịch mã ngăn chặn nhận dạng kháng thể.
- Các vấn đề biểu hiện protein mục tiêu: Protein đích có thể có biểu hiện rất thấp hoặc không có biểu hiện trong các tế bào hoặc mô được phát hiện.
Ii. Nền cao
Lý do có thể có thể bao gồm:
- Nồng độ kháng thể cao: Sử dụng quá nhiều kháng thể có thể làm tăng liên kết không đặc hiệu, dẫn đến nền cao.
- Các vấn đề về chất lượng kháng thể: Kháng thể có thể có liên kết không đặc hiệu hoặc phản ứng chéo với các protein khác.
- Chặn không đủ: dung dịch chặn không thể bao phủ hiệu quả các vị trí liên kết không đặc hiệu trên màng, dẫn đến nền cao.
- Các vấn đề về màng: màng có thể có chất lượng kém hoặc ô nhiễm, dẫn đến nền cao.
- Chuyển giao không đầy đủ: Trong quá trình chuyển, protein có thể không được chuyển hoàn toàn vào màng, dẫn đến nền cao.
- Không đủ rửa: Các bước rửa không loại bỏ hiệu quả kháng thể hoặc tạp chất khác, dẫn đến nền cao.
- Các vấn đề về thuốc thử nhuộm: Thuốc thử nhuộm có thể quá nhạy cảm hoặc không ổn định, dẫn đến nền cao.
- Các vấn đề về thiết bị thử nghiệm: Thiết bị có thể bị rò rỉ hoặc nhiễu, dẫn đến nền cao.
- Các vấn đề mẫu protein: Mẫu có thể chứa một lượng lớn các chất gây nhiễu, chẳng hạn như các sản phẩm thoái hóa protein hoặc các tạp chất khác.
- Các vấn đề hoạt động thử nghiệm: Hoạt động thử nghiệm có thể không được tiêu chuẩn hóa, chẳng hạn như thời gian ủ bệnh kéo dài hoặc nhiệt độ cao.
Iii. Các dải không đặc hiệu hoặc kích thước dải protein không chính xác
Lý do có thể có thể bao gồm:
- Quá nhiều đoạn của các tế bào, dẫn đến các mức biểu hiện protein khác nhau, dẫn đến kích thước dải không nhất quán hoặc sự hiện diện của nhiều dải.
- Suy thoái mẫu protein, dẫn đến trọng lượng phân tử protein thấp hơn hoặc sự hiện diện của nhiều dải.
- In vivo thể hiện các mẫu protein có thể có các dạng sửa đổi khác nhau như acetyl hóa, methyl hóa, kiềm hóa, phosphoryl hóa và glycosyl hóa, dẫn đến kích thước dải không nhất quán hoặc sự hiện diện của nhiều dải.
- Protein đích chứa nhiều biến thể đồng dạng hoặc các biến thể mối nối, dẫn đến kích thước dải không nhất quán hoặc sự hiện diện của nhiều dải.
